Тест-система «Фемофлор»: количественный и качественный анализ биоценоза влагалища

Влагалищный биоценоз представлен ассоциацией микроорганизмов, обеспечивающих поддержание местного иммунитета и гомеостаза организма женщины в целом.

В зависимости от множества факторов состав биоценоза может динамически изменяться, но тем не менее стремится оставаться в равновесном состоянии. Для характеристики влагалищной микрофлоры используются несколько лабораторных методов, в том числе и "Фемофлор". Что это за анализ, какие виды его используют в повседневной практике врача, разберем подробнее.

1. Микрофлора влагалища

К изменениям биоценоза влагалища приводят такие факторы, как:

1. 1 Гормональный статус женщины;
2. 2 Возраст;
3. 3 Образ жизни, характер питания;
4. 4 Половое поведение и смена полового партнера;
5. 5 Способ предохранения;
6. 6 Иммунный статус;
7. 7 Акушерско-гинекологический анамнез;
8. 8 Реализация репродуктивной функции;
9. 9 Прием лекарственных средств (гормональных, антибактериальных);
10. 10 Экстрагенитальная патология.

Все эти факторы так или иначе сказываются на составе влагалищной флоры женщины, при нарушении ее баланса возможно развитие гинекологических заболеваний.

Важен не столько качественный, сколько количественный состав микробиоты (особенно для факультативной флоры).

В ходе исследований в рамках проекта "Микробиом человека" (2012г., США) была доказана ведущая роль не только состояния равновесия микрофлоры урогенитального такта, но и дисбиотических нарушений в реализации репродуктивной функции и качества жизни женщины в целом.

Было исследовано и доказано влияние инфекций урогенитального тракта, дисбиотических процессов в этиологии самопроизвольных выкидышей, преждевременных родов, , внутриутробного инфицирования и патологий развития плода, бесплодия, привычного невынашивания беременности.

Одним из самых информативных анализов в работе акушер-гинеколога является исследование состава влагалищной флоры, как качественного, так и количественного.

Один из рутинных и самых недорогих методов – это микроскопия мазка. Как бы не был хорош этот метод, он имеет ряд недостатков:

1. 1 Человеческий фактор. Оценка мазка осуществляется лаборантом, поэтому результат мазка на флору зависит от опытности и квалификации персонала лаборатории.
2. 2 Не всегда есть гарантия правильности забора мазка, иногда не получается захватить достаточное количество патогенной флоры.
3. 3 При микроскопии обнаруживаются не все инфекционные агенты (например, при простой микроскопии не видны уреаплазмы, микоплазмы, хламидии). Для их обнаружения необходимы дополнительные исследования, что затягивает постановку диагноза.

В настоящее время в РФ разработана специальная система для оценки влагалищной флоры методом ПЦР «здесь и сейчас» – тест-система «Фемофлор». Этот метод широко используется в амбулаторных условиях.

2. История возникновения

Система Фемофлор разработана и апробирована в 2008-2009 годах компанией «ДНК-Технологии» в России. Главная ее задача – исследование состава микрофлоры урогенитального тракта женщин.

В 2014 году данная разработка признана победителем премии «Призвание». На данный момент метод широко используюется в акушерско-гинекологической практике, включен в список оказания высокотехнологичной помощи по профилю «Акушерство и гинекология».

3. Что такое Фемофлор?

Фемофлор - это тест-система для определения количественного и качественного состава влагалищной флоры методом обнаружения ДНК бактерий, увеличения их количества и идентификации в пределах реального времени.

1. 1 Определить общую бактериальную массу.
2. 2 Дать количественную оценку нормофлоры.
3. 3 Дать количественную оценку факультативной флоры, ее корреляцию с общим составом бактерий.
4. 4 Выполнить контроль забора материала для исследования.

4. Биохимические основы

В основе проведения анализа с помощью набора реагентов «Фемофлор» лежит полимеразная цепная реакция (ПЦР) с амплификацией (увеличение количества копий) ДНК.

Любая элементарная ПЦР состоит из следующих этапов:

1. 1 Расплетение нитей ДНК.
2. 2 Отжиг – то есть присоединение коротких нитей ДНК-затравок (праймеров), которые необходимы для дальнейшего образования нуклеиновых кислот.
3. 3 Комплементарное достраивание новых нитей – образование новой цепи ДНК.

Для успешного проведения ПЦР-диагностики необходимы следующие материалы:

1. 1 ДНК-матрица, то есть участок, подлежащий амплификации;
2. 2 Два комплементарных праймера (затравки);
3. 3 ДНК-полимераза термостабильная – фермент, необходимый для катализа реакции полимеризации;
4. 4 Дезоксирибонуклеофосфаты – строительный материал;
5. 5 Соли магния – для работы ДНК-полимеразы;
6. 6 Буферный раствор.

Проще говоря, не важно сколько исследуемого материала было взято. Даже минимальное его количество будет увеличено в количестве и идентифицировано.

5. Наборы реагентов

Набор реагентов «Фемофлор» состоит из:

• Комплекс для обнаружения общего количества бактерий;
• Комплекс для обнаружения состава и количества нормофлоры (Lactobacillus spp.);
• Комплекс для обнаружения состава и количества факультативной флоры (состав зависит от комплектации Фемофлор-16 (17), Фемофлор-8 (9), Фемофлор-4, Фемофлор Скрин).

С помощью набора «Фемофлор» можно проконтролировать правильность течения процесса с помощью контрольной пробирки, а также правильность забора материала с помощью пробирки с комплексом для обнаружения генома человеческой ДНК.

В каждую реакционную смесь системы Фемофлор введены специальные ДНК-зонды, несущие в себе флуоресцентную составляющую (метку) в сочетании с гасителем флуоресценции.

Действие гасителя прекращается при наличии специфических продуктов разрушения ДНК-зонда, после чего возникает флуоресценция. Чем больше этих специфических ампликонов, тем ярче будет свечение (флуоресценция).

Чтобы увеличить специфичность и чувствительность реакции, применяют метод «горячего» старта. При этом реакционная смесь разделена на 2 прослойки с помощью парафина. Слои смешиваются и превращаются в реакционную смесь только при плавлении парафина в детекторе, исключая неспецифический отжиг праймеров.

6. Преимущества и недостатки метода

Чувствительность метода при оценке дисбиотических нарушений составляет 88%, а специфичность – 89%. При диагностике бактериального вагиноза чувствительность Фемофлора выше и достигает порядка 95%.

Таким образом, основным преимуществом тест-системы Фемофлор является его достаточная чувствительность и специфичность в отношении ведущих патогенов урогенитальной сферы женщины, независимо от их видовой принадлежности (бактерии, грибы, вирусы, простейшие).

К плюсам метода можно отнести:

1. 1 Быстроту и простоту исполнения;
2. 2 Минимальную зависимость от человеческого фактора, имеющийся контроль правильности взятия мазка;
3. 3 Возможность оценки количества и качества факультативной и нормальной флоры, возможность оценки соотношения между разными видами микроорганизмов;
4. 4 Одновременное обнаружение различных возбудителей (бактерий, простейших, вирусов, грибов);
5. 5 Отсутствие противопоказаний к назначению данного метода.

1. 1 Стоимость метода. Фемофлор не входит в список бесплатно оказываемых услуг (за исключением программы высокотехнологической медицинской помощи), что зачастую останавливает пациентку от выполнения анализа.
2. 2 Перед сдачей анализа появляется необходимость в соблюдении ряда условий (например, необходимо исключить незащищенные половые контакты за 48-72 часа до сдачи анализа).

7. Какие микроорганизмы можно обнаружить с помощью анализа?

1. 1 Lactobacillus spp. – нормальная флора влагалища, грамположительные факультативно анаэробные или микроаэрофильные палочки. Во влагалище продуцируют молочную кислоту, чем обеспечивают кислую среду и поддержание местного иммунитета.
2. 2 Enterobacterium spp. – грамотрицательные споронеобразующие палочки, представители факультативных анаэробов.
3. 3 Streptococcus spp. – грамположительные бактерии округлой формы, располагающиеся цепочкой, относящиеся к факультативным анаэробам.
4. 4 Staphylococcus spp. – грамположительные бактерии круглой формы, факультативные анаэробы.
5. 5 Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp. – бактерии, зачастую ответственные за развитие бактериального вагиноза, факультативные анаэробы.
6. 6 Eubacterium spp. – одноклеточные бактерии самой различной формы (от овоидной до звездчатой).
7. 7 Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp. – грамотрицательные споронеобразующие анаэробные бактерии, представители факультативной флоры.
8. 8 Megasphaera spp./Veilonella spp./Dialister spp. – грамотрицательные споронеобразующие кокковидные анаэробные бактерии.
9. 9 Lachnobacterium spp./Clostridium spp. – грамположительные, палочки, способные продуцировать эндоспоры, представители облигатных анаэробов.
10. 10 Mobyluncus spp./Corynebacterium spp. – грамположительные палосковидные, вибрионовидные бактерии, облигатные анаэробы.
11. 11 Peptostreptococcus spp. – факультативные грамположительные анаэробные кокки.
12. 12 Atopobium vaginae – грамположительные анаэробные палочки, маркер бактериального вагиноза.
13. 13 Mycoplasma genitalium+hominis – микроорганизмы без клеточной стенки, внутриклеточный паразит. Mycoplasma genitalium в норме отсутствуют в организме женщины.
14. 14 Ureaplasma (urealyticum + parvum) – внутриклеточный паразит, без клеточной стенки, может в норме обнаруживаться во влагалищной биоте у женщины.
15. 15 Candida spp. – диплоидный дрожжеподобный грибок, возбудитель вагинального кандидоза.

В зависимости от комплектации различают несколько видов теста Фемофлор (см. таблицу ниже).

Таблица 1 - Виды анализа Фемофлор: Фемофлор 4, Фемофлор 8 (Фемофлор 9), Фемофлор 16 (Фемофлор 17)

8. Оценка и расшифровка результатов

Оценивается общее количество бактерий в исследуемом материале – общая бактериальная масса. Нормальные ее значения колеблются в пределах 10 8 -10 9 ГЭ/образец.

Снижение этого показателя ниже 10 5 чаще всего свидетельствует о проведенном курсе лечения (применение антибиотиков и антисептиков). Повторить такой анализ рекомендуется через 14 дней.

Снижение показателя у женщин в перименопаузе или постменопаузе является доказательством атрофических процессов.

В идеале нормальная флора женщины представлена микроорганизмами Lactobacillus spp, их количество равно общей бактериальной массе, то есть 10 8 -10 9 ГЭ/образец.

В ходе анализа проводится корреляция общего количества бактериальной массы, лактобацилл и доли факультативной флоры.

При нормоценозе доля лактобацилл составляет не менее 95%. Снижение ее до 80% говорит о умеренном дисбиозе, а до 20% - о крайне выраженном нарушении состава флоры.

При выявлении нарушений биоценоза необходимо анализировать превалирующую долю сопутствующей флоры.

Если преобладает факультативно-анаэробная флора, то дисбиоз расценивается как аэробный, если облигатно-анаэробная – то как анаэробный.

При одинаковом их соотношении говорят о смешанной этиологии.

Таблица 2 - Нормальные значения влагалищной микрофлоры в зависимости от вида микроорганизма

Таблица 3 - Патогенная флора, выявляемая при выполнении Фемофлор Скрин. Для просмотра кликните по таблице

9. Показания к проведению анализа

В целом ограничений к назначению исследования влагалищного мазка нет.

Но чаще всего Фемофлор назначают для:

1. 1 Идентификации возбудителя при инфекционном процессе (появление патологических белей, их неприятный запах) и назначения адекватной этиотропной терапии.
2. 2 Изучения состава влагалищной флоры, ее качественной и количественной составляющих.
3. 3 Постановки диагноза при расхождении клинических и лабораторных данных.
4. 4 Скрининга при беременности (во всех триместрах).
5. 5 Скрининга при предгравидарной подготовке.
6. 6 В качестве дополнения к микроскопическому исследованию для оценки состояния биоценоза здоровых женщин.
7. 7 Подтверждения диагноза «бактериальный вагиноз» с определением факультативной флоры с патологическим характером роста.
8. 8 Контроля эффективности терапии.
9. 9 Мониторинга восстановления нормальной флоры.

Противопоказаний к проведению анализа нет. Единственным условием является правильное выполнение забора и транспортировки исследуемого материала.

Для уточнения этиологии гинекологических заболеваний иногда необходимо дополнительно анализировать наличие абсолютных патогенов (хламидии, гонококки, трихомонады) с помощью метода ПЦР.

Наличие данных микроорганизмов исследуется в формате реактивов «Фемофлор Скрин», куда дополнительно входит определение:

1. 1 Neisseria gonorrhoeae
2. 2 Herpesvirus 1
3. 3 Chlamydia trachomatis
4. 4 Trichomonas vaginalis
5. 5 Citomegalovirus
6. 6 Herpesvirus 2

Когда и какой Фемофлор назначается, рассмотрим ниже.

Проводится оценка общего состояния биоценоза. Целесообразно применять при симптомокомплексах вульвовагинального кандидоза, бактериального вагиноза, либо с целью оценки эффективности проведенной терапии.

Проводится более расширенная оценка состояния биоценоза. Также применяют при симптомах кандидоза, бактериального вагиноза, а также с целью оценки качества проведенных лечебных мероприятий, неспецифического вагинита.

Детально анализируется состав флоры. Назначается при хронических рецидивирующих инфекционных процессах, при предгравидарной подготовке, подготовке к операциям, гистероскопии, ЭКО, введению ВМС, а также для оценки качества проведенной терапии.

Дополнительно анализируется наличие специфической инфекции и вирусов. Назначается при явлениях специфической инфекции (гонорея, трихомониаз), генитальном герпесе, вторичном бесплодии, наличии спаечных процессов в малом тазу, патологии беременности, при предгравидарной подготовке, хронических кольпитах и цервицитах.

10. Правила забора и транспортировки материала

Для исследования необходимо взятие соскоба из задне-бокового свода влагалища, цервикального канала или уретры.

До забора предварительно следует ознакомить женщину с некоторыми нюансами подготовки к исследованию:

1. 1 Необходимо закончить курс терапии антибактериальными препаратами за 14 дней до исследования;
2. 2 Необходимо закончить курс терапии эубиотиками и пробиотиками за 14 дней до исследования;
3. 3 Исключить защищенные половые контакты непосредственно перед исследованием, незащищенные – за 48 часов до взятия соскоба;
4. 4 Исключить применение тампонов за сутки до забора материала;
5. 5 Выждать 48-часовой промежуток после кольпоскопии и трансвагинального УЗИ.

Перед осуществлением забора женщина НЕ должна проводить гигиенические процедуры и спринцевания, вводить лекарственные и антисептические свечи.

Материал представляет собой соскоб эпителиальных клеток. Чаще всего забор из заднебокового свода берется для оценки биоценоза влагалища.

Производится во время осмотра влагалища в зеркалах, строго ДО мануального исследования. Важным условием является отсутствие патологической слизи, крови из места забора, при необходимости – их механическое удаление стерильным ватным тампоном. При неправильном взятии соскоба и результат анализа будет недостоверным.

Соскоб берут специальным одноразовым зондом, который затем помещают в пробирку с питательной средой (1,5 мл «Эппендорф» с питательной средой), тщательно его прополаскивают в среде, затем зонд утилизируют.

Пробирку обязательно маркируют и плотно закрывают крышкой.

Обычно проводится при подозрении на патологию шейки матки (цервицит). Если патологический процесс виден в зеркалах, то рекомендуется брать материал именно из этого участка.

Важным условием забора является отсутствие посторонних примесей и слизи, которые можно ликвидировать простерилизованным ватным тампоном, после чего шейка обрабатывается стерильным раствором 0,9% натрия хлорида.

В цервикальный канал вводят специальный зонд на глубину не более 1,5 см, круговым движением очерчивается полный круг, после этого зонд извлекается. На данном этапе важно не задеть стенки влагалища (результат может быть недостоверным).

Перед взятием мазка из уретры пациентке рекомендуют выждать 1,5-2 часовой перерыв после последнего мочеиспускания.

Уретру, а точнее ее наружное отверстие, предварительно смачивают стерильным раствором 0,9% раствором натрия хлорида, после этого можно производить забор материала.

Если у пациентки имеются обильные специфические (гнойные или слизистые) выделения, двухчасовой интервал между последним мочеиспусканием и временем забора материала можно не соблюдать.

Зонд вводится на глубину 1-1,5 см одним движением, а затем извлекается без каких-либо дополнительных манипуляций.

После забора материала для исследования пробирка маркируется, к ней прикрепляется направление, в котором указывается предварительный диагноз, дату последней менструации или причину ее отсутствия (менопауза, аменорея).

Транспортировка осуществляется специально обученным лаборантом. Допускается замораживание материала при температуре -20 С на срок не более 1 месяца.